Секвенирование по Сэнгеру, также известное как метод терминации цепи, произвело революцию в молекулярной биологии и геномике. Разработанный Фредериком Сэнгером и его коллегами в 1977 году, этот метод позволил ученым определить точный порядок нуклеотидов в молекулах ДНК. Этот метод стал основополагающим в многочисленных генетических открытиях и был основным методом секвенирования, использованным в проекте «Геном человека». В этой статье мы подробно рассмотрим принципы, процесс и применение секвенирования по методу Сангера. подробнее об этом можно узнать по адресу https://www.genoanalytica.ru/sanger-sequencing
Принципы секвенирования по Сэнгеру
Основной принцип секвенирования по Сангеру основан на избирательном включении ДНК-полимеразой оканчивающих цепь дезоксинуклеотидов (ddNTPs) во время репликации ДНК. В отличие от обычных дезоксинуклеотидов (dNTPs), ddNTPs не имеют гидроксильной группы на 3′ углероде, что предотвращает присоединение дальнейших нуклеотидов после их включения. Это приводит к прекращению элонгации нити ДНК. Если включить в процесс репликации смесь обычных dNTP и флуоресцентно меченых ddNTP, то образуется серия фрагментов ДНК разной длины, каждый из которых заканчивается на ddNTP.
Процесс секвенирования по методу Сэнгера
- Процесс начинается с выделения сегмента ДНК, подлежащего секвенированию. Затем целевая ДНК денатурируется в одноцепочечную путем нагревания. Короткий одноцепочечный ДНК-праймер, комплементарный 3′ концу шаблонной нити, отжигается на шаблонной ДНК, обеспечивая отправную точку для синтеза ДНК.
- Шаблон ДНК, праймер, ДНК-полимераза, dNTPs и небольшая часть ddNTPs (каждый из которых помечен своим флуоресцентным красителем) смешиваются в реакционной пробирке. ДНК-полимераза удлиняет праймер, добавляя комплементарные dNTP к растущей нити ДНК. Иногда вместо одного из dNTP присоединяется другой, прекращая удлинение. В результате образуется смесь фрагментов ДНК разной длины, каждый из которых заканчивается в точке, где был включен ddNTP.
- Смесь фрагментов ДНК затем подвергается капиллярному гель-электрофорезу. По мере того как фрагменты мигрируют через гель, они разделяются по размеру. Самые маленькие фрагменты движутся быстрее всего, а самые большие — медленнее. Лазер на конце капилляра обнаруживает флуоресцентно меченные ddNTPs, что позволяет определить терминальный нуклеотид каждого фрагмента. Последовательность обнаруженных цветов соответствует последовательности ДНК.
- Результатом электрофореза является серия цветных пиков, каждый из которых представляет собой отдельный нуклеотид. Специализированное программное обеспечение переводит эти пики в читаемую последовательность ДНК. В результате получается линейная последовательность нуклеотидных оснований (аденин, тимин, цитозин и гуанин), которая представляет собой последовательность ДНК-шаблона.
Области применения секвенирования по методу Сэнгера
- Секвенирование Сангера сыграло важную роль в генетических исследованиях, позволив выявить гены, мутации и генетические вариации. Оно облегчило изучение наследственных заболеваний, генетики рака и геномики микроорганизмов. Сравнивая последовательности, исследователи могут выявить мутации, связанные с заболеваниями, что помогает в разработке диагностических тестов и целевых методов лечения.
- Проект «Геном человека» — амбициозная попытка составить карту всего генома человека — в значительной степени опирался на секвенирование по методу Сэнгера. Завершившись в 2003 году, этот проект позволил получить эталонную последовательность генома человека, что произвело революцию в нашем понимании генетики человека и проложило путь к персонализированной медицине.
- В клинических условиях секвенирование по Сэнгеру используется для подтверждения генетических мутаций, выявленных другими методами, такими как секвенирование следующего поколения (NGS). Оно также используется для секвенирования специфических генов, связанных с наследственными заболеваниями. Высокая точность и надежность делают его золотым стандартом генетического тестирования.
- В криминалистике секвенирование Сангера используется для профилирования ДНК, помогая идентифицировать людей на основе их уникального генетического состава. Такое применение имеет решающее значение при расследовании уголовных дел, установлении отцовства и идентификации останков при опознании жертв катастроф.
- Секвенирование Сангера внесло значительный вклад в эволюционную биологию, позволив понять генетические связи между различными видами. Сравнивая последовательности ДНК, ученые могут реконструировать историю эволюции и понять генетическую основу адаптации и видообразования.
Преимущества и ограничения
Преимущества
Секвенирование по методу Сэнгера известно своей высокой точностью и надежностью, что делает его пригодным для секвенирования небольших фрагментов ДНК и проверки результатов, полученных другими методами секвенирования. Он позволяет получать большие длины чтений, обычно около 700-1000 пар оснований, что выгодно для некоторых приложений, таких как секвенирование повторяющихся областей и больших генов.
Ограничения
- Несмотря на свою точность, секвенирование по методу Сэнгера имеет свои ограничения. Оно относительно медленное и дорогое по сравнению с новыми методами, такими как NGS, что делает его менее подходящим для высокопроизводительных приложений. Требование высококачественных образцов ДНК и трудоемкость процесса также ограничивают его эффективность для крупномасштабных проектов.
- Несмотря на то что технологии секвенирования нового поколения во многом вытеснили секвенирование по Сэнгеру из многих приложений благодаря более высокой пропускной способности и низкой стоимости, секвенирование по Сэнгеру остается краеугольным камнем молекулярной биологии. Его точность и надежность по-прежнему делают его неоценимым для конкретных применений, особенно в клинической диагностике и исследованиях, требующих детального и точного секвенирования ДНК.
- В заключение следует отметить, что секвенирование по Сэнгеру оказало глубокое влияние на генетику и другие области. Его разработка ознаменовала значительный прогресс в нашей способности считывать генетический код, что привело к революционным открытиям и достижениям в медицине, биологии и многих других областях. Несмотря на появление более совершенных технологий, фундаментальные принципы и области применения секвенирования Сангера обеспечивают его неизменную актуальность в научном сообществе.
В заключение следует отметить, что секвенирование по Сэнгеру оказало глубокое влияние на генетику и другие области. Его разработка ознаменовала значительный прогресс в нашей способности считывать генетический код, что привело к революционным открытиям и достижениям в медицине, биологии и многих других областях. Несмотря на появление более совершенных технологий, фундаментальные принципы и области применения секвенирования Сангера обеспечивают его неизменную актуальность в научном сообществе.
